Muhammad Thamrin Hidayat – Dosen FKIP
AKHIR-akhir ini di media massa manapun selalu membicarakan tentang PCR berkaitan wabah Covid19. Beberapa orang awan tentu kurang memahami apa itu PCR. Polymerase Chain Reaction yang sering disingkat dengan PCR (Polymerase Reaksi Berantai) ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983.
PCR adalah satu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida (DNA) tertentu secara in vitro. Kary mendapat hadiah Hadiah Nobel di Ilmu kimia di 1994 atas penemuannya. Metode ini dikembangkan lebih lanjut oleh seorang peneliti Cetus dan kemudian di Hak patenkan oleh Cetus Corporation. Penerapan PCR banyak dilakukan dibidang biokimia dan biomolekuler karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang sangat sedikit.
Dari hasil penemuannya itu sampai saat ini telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik. Perkembangan awal metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi dalam perkembangan selanjutnya dapat digunakan pula melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul mRNA.
Sebenarnya DNA polymerase yang terjadi secara alami di organisma-organisma hidup. Di dalam sel-sel polymerase berfungsi menjadi salinan DNA ketika sel-sel mengadakan mitosis atau meiosis.
Metode PCR memiliki kepekaan yang sangat tinggi, sehingga dapat digunakan untuk melipatgandakan DNA walaupun satu melekul DNA sekalipun. Di samping itu juga, metode ini sering digunakan untuk memisahkan gen-gen berkopi tunggal dari se kelompok sekuen genom. Metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu fragmen DNA (110bp, 5 X10-19mol) menjadi 200.000 kali bila dilakukan 20 siklus dalam jangka waktu hanya 220 menit. Dengan demikian keunggunalan metode PCR dapat melipatgandakan satu fragmen DNA secara cepat dan mendapatkan hasil yang sangat banyak. Ukuran kecil fragmen misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µ sedangkan oligonukelotida yang dibutuhkan hanya 1mM dan reaksi ini dapat dilakukan hanya dalam volume 50 – 100µ. Selain itu DNA cetakan yang digunakan tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu. Jadi bila akan melipatgandakan satu sekuen DNA bakteri atau virus dengan metode PCR, cukup mencampurkan ke dalam kultur tersebut di dalam tabung PCR.
Pada awalnya metode PCR bagian sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu. Sekuen yang harus diketahui adalah primer, yaitu sekuen oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis dalam PCR. Perkembangan selanjutnya dapat dilakukan tanpa mengetahui sekuennya. Hal ini dilakukan pada Alu yaitu suatu sekuen DNA yang memiliki panjangnya kurang lebih 300bp yang banyak terdapat pada genom manusia (repetitive DNA sequence). Alu-PCR adalah metode PCR yang memanfaatkan sekuen-sekuen Alu sebagai dasar untuk membuat primer untuk melipatgandakan suatu fragmen DNA yang belum diketahui sekuennya yang terdapat di antara sekuen Alu.
Prinsip pelaksanaan PCR ada empat komponen dasar dalam prosesnya yaitu:
- DNA Cetakan, adalah suatu fragmen yang akan dilipatgandakan
- Oligonukleotida primer, yaitu sekuen oligonukleotida pendek sekitar 15 -25 basa nukeotida. Sekuen oligonukleotida ini digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA
- Deoksiribonukeotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
- Enzim DNA polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi rantai DNA, di samping bahan lain yang sangat penting adalah senyawa buffer.
Melipatgandakan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi atau juga disebut melting (peleburan) DNA template (cetakan), bertujuan agar rantai DNA ganda dapat terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded), karena ikatan hidrogen putus. Pelaksanaan denaturasi dengan menggunakan temperatur 940 C – 960C selama 1 – 2 menit, kemudian suhu diturunkan hingga mencapai 550C yang bertujuan agar primer akan “menempel/penempelan” (annealing) pada rantai tunggal (single stranded).Primer yang diberikan akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu rendah yaitu 370C, namun hal ini sering terjadi penempelan yang salah atau disebut mispriming. Bila menggunakan suhu 550C spisifikasi reaksi amplifikasi akan meningkat tetapi secara keseluruhan efesiensinya akan menurun.
Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat dan oligonukleotida yang ke dua identik dengan sekuen pada ujung 3’-OH rantai DNA cetakan yang lain. Waktu proses anneling biasanya dilakukan selama 1 – 2 menit, kemudian suhu dinaikkan menjadi 720C selama 1,5 menit. Disinilah DNA polimerase akan melakukan polimeasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi DNA cetakan. Setelah terjadi polimerase maka akan diikuti pembentukan jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. Rantai DNA ganda yang baru terbentuk baik rantai DNA yang baru dengan rantai DNA cetakan hasil polimerasi kemudian dinaturasi lagi dengan jalan suhu inkubasi dinaikkan mencapai 950C. Rantai-rantai yang baru terbentuk akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerase berikutnya. Untuk mendapat rantai DNA yang banyak, reaksi-reaksi tersebut diulang-ulang hingga 25 sampai 30 kali siklus. Di samping itu banyaknya siklus amplifkasi tergantung dari konsentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Berdasarkan pengalaman untuk genom mamalia diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopi sekuen DNA agar hasilnya dapat dilihat dalam elektroforosis gel agarose.
Secara singkat keterangan di atas dapat digambarkan seperti di bawah ini:.
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:
- Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94–96°C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat (“patokan”) bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.
- Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60°C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
- Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-polimerase (P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76°C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit
Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1 hingga tahap 4 pada gambar menunjukkan perkembangan yang terjadi pada siklus-siklus selanjutnya. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru menjadi templet bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial. *
